PCR实验是专门用来检验艾滋病、乙型肝炎、禽疫病等病毒感染性疾病的一种检测手段。其基本原理:PCR(Polymerase Chain Reaction)即聚合酶链式反应,又称无细胞分子克隆系统和体外酶促基因扩增法。是基因扩增技术的一次重大革新,它可将极微量的靶DNA特异地扩增上百万倍。PCR是在DNA聚合酶催化下,以母链DNA为模板以特定引物为延伸起点,通过变性、退火、延伸等步骤,体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。是一项DNA体外合成放大技术,能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。可用于基因分离克隆,序列分析,基因表达调控,基因多态性研究等许多方面。
试剂准备区:该实验区主要进行的操作为贮存试剂的制备。试剂的分装和反应混合液的制备。试剂原材料必须贮存在本区内,并在本区内制备成所需的试剂。对于气流压力的控制,本区并没有严格的要求。标本制备区:该区域主要进行的操作为临床标本的保存、核酸(RNA、DNA) 提取、贮存及其加入至扩增反应管。本区的压力梯度要求为:相对于试剂准备区为负压,以避免从邻近区进入本区的气溶胶污染。基因扩增区:该区域主要进行的操作为DNA和cDNA扩增。本区的压力梯度要求为:相对于标本制备区为负压,以避免气溶胶从本区漏出。扩增产物分析区:该区域主要进行的操作为扩增产物的测定。如使用全自动封闭分析仪器检测,此区域可不设。本区是最主要的扩增产物污染来源,因此对本区的压力梯度的要求为:相对于基因扩增区为负压,以避免扩增产物从本区扩散至其他区域。临床PCR乐动(中国)设计的一般原则:“十六字口诀”
各区独立、注意风向、因地制宜、方便工作
整个区域有一个公用走廊,每个独立实验区设置有专门的缓冲区。通过压差控制,使整个PCR实验过程中试剂和标本免受气溶胶的污染,并且降低扩增产物对人员和环境的污染。
标准PCR乐动(中国)建设的原则:工作有序、互不干扰、防止污染、报告及时。
1、PCR乐动(中国)的空气流向必须严格按照试剂储存和准备区→标本制备区→扩增区→扩增产物分析区空气压力逐渐递减方式进行,防止扩增产物顺空气气流进入扩增前的区域。2、空气洁净级别不同的相邻房间之间的静压差应大于5帕,洁净室(区)与室外大气的静压差应大于10帕,应配备监测静压差的设备,并定期监控。通过控制进风风量与排风风量达到压力效果。 一般情况下,试剂配制室及样品处理室宜呈微正压,以防外界含核酸气溶胶的空气进入造成污染;核酸扩增室及产物分析室应呈微负压,以防含核酸的气溶胶扩散出去污染试剂与样品;PCR乐动(中国)缓冲间内,可设置正压,使室内空气不流向室外,室外空气不流向室内。二、洁净装修要求
1、洁净室(区)的内表面应平整光滑、无裂缝、接口严密、无颗粒物脱落,并能耐受清洗和消毒,墙壁与地面的交界处宜成弧形或采取其他措施,以减少灰尘积聚和便于清洁。
2、洁净室(区)内各种管道、灯具、风口以及其他公用设施,在设计和安装时应考虑使用中避免出现不易清洁的部位
3、洁净室(区)的窗户、天棚及进入室内的管道、风口、灯具与墙壁或天棚的连接部位均应密封。
三、工作服要求
1、进入各个区域必须严格按照单一方向进行,不同的工作区域使用不同的工作服(例如不同的颜色)。工作人员离开时,不得将工作服带出。2、各工作区域内配置专用的工作服和工作鞋,工作服要求不同颜色,工作鞋要求包裹整个脚面,并且在工作服和工作鞋上标记工作区域名称。四、人流路径与物流路径
进入乐动(中国)区域工作人员应该按照以下路径:公共清洁区--更衣间(更换洁净服)--缓冲间--污染实验区
工作人员退出乐动(中国)的路径为:污染试验区--缓冲间--淋浴间(有条件的可设置)--更衣间--公共清洁区
所有的物品进入实验区必须经过传递窗,利用传递窗消毒后才可进入,乐动(中国)内所有物品的也必须经过传递窗才可以传递到其他实验区。
五、门的开启方向
1、一般乐动(中国)门主要向里开,但如有危险的房间,房门应朝外开;
2、有压差梯度的房间,门的开启方向应朝向正压方向一侧开启;
3、考虑到消防安全,对于那些主要逃生门的开启方向应朝向清洁区方向开启。